A görögszéna mag és diosgenin hatóanyagának anyagcserére gyakorolt hatásainak vizsgálata

A görögszéna az ősidők óta használt gyógynövények közé tartozik, a gyógyszerkönyvekben jelenleg is hivatalos drogként szerepel. Számos biológiailag aktív hatóanyagot tartalmaz, például mézgát, aminosavakat, mikro- és makrotápanyagokat, vitaminokat. Keserűanyagai a szaponinok, melyeknek a görögszéna legtöbb élettani hatása tulajdonítható.

Kísérletünkben a görögszéna mag és egyik szaponinjának, a diosgeninnek a hatását vizsgáltuk egészséges, illetve inzulin rezisztens patkányokon. Ez utóbbi állatmodellt zsírdús táp (highfatdiet, HFD) és cukros víz krónikus adásával hoztuk létre. A 6 hetes kezelés alatt az állatok metabolikus paramétereit naponta mértük, vizsgáltuk a bélmotilitást, és az inzulinérzékenységet, melyet a kísérlet végén inzulin- és glükóz tolerancia teszttel, valamint hyperinzulinaemiás euglycaemiás glükóz clamp-el határoztuk meg [4, 5].

Metodika

A kísérletet 60 db hím Wistar patkánnyal végeztük. Az állatokat 6 csoportra osztottuk. A kontroll csoport standard laboratóriumi tápot és csapvizet kapott, a HFD kontroll csoport zsírdús tápot és cukros vizet, a kezelt 4 csoport pedig zsírdús tápon és cukros vízen volt tartva, és naponta 1 mg/kg, 10 mg/kg vagy 50 mg/kg diosgenint, vagy 0,6 g/kg görögszénát kapott szájon át.

Metabolikus mérések

A metabolikus ketrecekben tartott állatok testsúlyát, táp- és vízfogyasztását, valamint széklet- és vizeletürítését naponta mértük. A dobozokban tartott állatok súlyát a kísérletek kezdetéig hetente kétszer mértük, a fogyasztott táp- és vízmennyiséget naponta határoztuk meg. A napi kalória bevitelt az alábbiak szerint számoltuk ki: standard táp: 3,2 kcal/g, HFD: 3,55 kcal/g, cukros víz: 0,2 kcal/ml.A kezelési periódus végpontján az állatok abdominális fehér zsírszövetét (retroperitoneális és gonadális) eltávolítottuk, azok súlyát lemértük.

Inzulinérzékenység meghatározása

Az inzulin- és glükóztolerancia meghatározására a kezelés 4. hetében került sor. Az inzulin tolerancia teszt(ITT) lényege az intraperitoneális (i.p.) inzulinterhelés hatására bekövetkező vércukorszint csökkenés mérése. A mérés során felvett görbe alapján számított görbe alatti terület (area under the curve, AUC) jellemzi a szövetek inzulinérzékenységét. Az ITT mérést 3 órás éheztetést követően kezdtük, előbb meghatároztuk a kezdeti vércukor értéket, majd az állatok i.p. 0,5 U/kg inzulint kaptak. Az inzulinterhelés után a 30., 60., 90. és 120. percben mértük a vércukorszinteket.

Az orális glükóztolerancia teszt (OGTT)segítségével a szövetek glükózfelvételét jellemezhetjük. A kísérletre egy éjszakát éheztetést követően került sor. A glükóz terhelés előtt farok vénából meghatároztuk az éhgyomri vércukor értéket, majd szájon át 2 g/kg glükózt adtunk. A glükózterhelés után a 15., 30., 60., 90. és 120. percben mértünk vércukor értékeket. A glükóztoleranciát az ITT-hez hasonlóan a görbe alatti terület alapján jellemeztük.

Az inzulin érzékenység meghatározásának legmegbízhatóbbnak tartott módszere a hyperinzulinaemiás euglycaemiás glükóz clamp (HEGC) [6]. A kísérletet megelőzően az állatokat 16 órán keresztül éheztettük, majd elaltattuk, és a nyaki régióba két vénás és egy artériás kanült ültettünk be. A műtét után folyamatos inzulin infúziót indítottunk 3 mU/kg/perc sebességgel, mellyel párhuzamosan 20 százalékos glükóz infúziót is adtunk. Az inzulin infúziót 120 percen át adtuk, ez idő alatt 10 percenként ellenőriztük a vércukor szintet,és a glükóz infúzió sebességét pedig úgy változtattuk, hogy a vércukor szint az 5.5±0.5 mmol/l tartományban maradjon.Az inzulin érzékenység azzal az átlagos glükóz infúziós rátával (GIR) jellemezhető, amely a kísérlet utolsó 30 percében az euglycaemia fenntartásához szükséges. Ez az érték jellemzi a perifériás inzulin érzékeny szövetek glükóz felvételét[6].

Bélmotilitás vizsgálat

A bélmotilitás meghatározása egy olyan szenzor beültetésével vált lehetővé, mely a hasfalról elektromos jeleket képes egy mérőrendszerbe továbbítani a bélmozgásokról. A szenzort a bélmotilitás mérés előtti napon altatásban műtöttük be az állatba. A hasi oldalon bemetszést ejtettünk és a szenzor mérőegységeit a hasfalra rögzítettük. A szenzor csatlakozóegységét a nyak háti részén vezettük ki.A gyomormotilitás meghatározását megelőzően az állatot egy éjszakán át éheztettük, és az EGG-01 simaizom miográfiás mérőrendszerre csatlakoztattuk. Az éhgyomri bélmotilitást 20 percen keresztül mértük, majd 2 ml metilcellulóz oldat itatása után a 0. 60. és a 180. percben még 20-20 percig folytattuk a mérést. A kísérlet végén a szondát altatásban eltávolítottuk az állatból.A mérés és a kapott adatok kiértékelése SPEL Advanced IsoSys szoftverrel történt.

Echocardiográfiás mérések

Az echocardiográfia vagy közismertebb nevén ultrahang egy olyan noninvazív, vagyis beavatkozással és fájdalommal nem járó képalkotó eljárás, melynek segítségével valós időben vizsgálható a szív munkája. A készülék nagyfrekvenciájú ultrahangot bocsát ki, ennek visszaverődéséből vizualizálja a szövetek mozgását. Számos leíró és funkciós paraméter meghatározására alkalmas, illetve több adat számolható vagy megbecsülhető a használatával, ezért igen hasznos diagnosztikai eszköz. Állatkísérletek során azonban több limitációval is számolni kell, hiszen használatához a páciensnek mozdulatlannak kell maradnia, amely laboratóriumi állatok esetében csak teljes anesztézia, vagyis altatás segítségével valósítható meg. További kihívást jelent a patkány szívének kis mérete az emberihez képest, így nagyobb jártasság és kézügyesség szükséges a vizsgáló személyek részéről.

Kísérleteink során a diosgeninnel, valamint a görögszénamag-őrleménnyel kezelt állatokról készítettünk echocardiográfiás felvételeket a kezelések lejártával. Az állatokat ketamin-xylazin eleggyel altatás alá helyeztük, mellkasukon a szőrt eltávolítottuk, majd elkészítettük az ultrahangos felvételeket. Meghatároztuk mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés szívfunkciókat, úgymint az ejekciós frakció és frakcionált rövidülés, szívfrekvencia, az egyes szövetrészek mozgási sebességei, az aortán történő kiáramlás nyomása, sebessége, a kamrai telődés korai és pitvari komponensének aránya, és myocardial performance index.

Eredmények

Metabolikus mérések

A 6 hetes kezelés testsúlyra gyakorolt hatása az 1. ábrán látható. A görögszénával és az 1 mg/kg-s diosgeninnel kezelt állatok testsúlya már a 4. naptól szignifikáns növekedést mutatott a kontroll csoporthoz képest, és ez a különbség végig megtartott maradt a kezelés végéig.

1. ábra. A diosgenin és görögszéna mag hatása a testsúlynövekedésre. A * szignifikáns különbséget jelent a kontroll csoporthoz viszonyítva.

A zsír- és cukordús táplálás hatására jól látható különbség alakult ki az abdominális zsír felszaporodásában a kontroll és HFD csoportok között, de nem érte el a szignifikáns szintet. A diosgenin különböző dózisai látszólag nem mutattak dózis-hatás összefüggést a krónikus kezelés és a fehér zsírszövet mennyisége között. A görögszénával etetett állatok viszont szignifikánsan többzsírt halmoztak fel a kontroll csoporthoz képest (2. ábra).

2. ábra. A diosgenin és görögszéna mag hatása a fehér zsírszövet mennyiségére. A * szignifikáns különbséget jelöl a kontroll csoporthoz viszonyítva.

A 3. ábra mutatja az állatok napi táp- és vízfogyasztását a kezelés időtartama alatt. A tápfogyasztást tekintve azt láttuk, hogy az összes HFD csoportban az állatok szignifikánsan kevesebbet ettek a kontroll tápon tartott csoporthoz képest (3A ábra), ugyanakkor a két nagyobb dózisú (10 és 50 mg/kg) diosgeninnel és a görögszénával kezelt csoport vízfogyasztása jelentősen megemelkedett (3B. ábra).

3. ábra. A diosgenin és görögszéna mag hatása a napi táplálékfelvételre és vízfogyasztásra. A * szignifikáns különbséget jelent a kontroll csoporthoz viszonyítva, a # szignifikáns eltérést jelöl a HFD kontroll csoporthoz képest.

A fenti eredmények alapján meghatároztuk a napi energiabevitelt. A zsírdús táp nagyobb kalóriaértékű a normál táphoz képest, valamint a HFD csoportoknak a cukros víz is plusz kalóriát jelentett. Megállapítottuk, hogy a HFD kontroll, illetve a diosgeninel kezelt csoportok kevesebb kalóriát vittek be a kontroll csoporthoz képest, viszont a görögszénával etetett állatok naponta szignifikánsan több energiát vettek fel a többi HFD csoporthoz képest (4. ábra).

4. ábra. A diosgenin és görögszéna mag hatása a napi kalóriabevitelre. A * szignifikáns különbséget jelent a kontroll csoporthoz viszonyítva, a # szignifikáns eltérést jelöl a HFD kontroll csoporthoz képest.

Inzulinérzékenység

Az ITT során az inzulin hatékonyságában nem találtunk változást, nincs különbség a görbe alatti területek nagyságában (5A ábra) a csoportok között.

Az OGTT vizsgálat során a kontroll, a HFD kontroll, illetve a diosgeninnel kezelt csoportok között nem találtunk lényeges eltérést. Azonban a görögszénás csoportban szignifikánsan nagyobb görbe alatti területet mértünk, ami romlott glükóz toleranciára utal, és ez az eltérés jelentős mind a normál, mind pedig a HFD kontrollokhoz képest (5B ábra).

5. ábra. A diosgenin és görögszéna mag hatása az inzulin és glükóz toleranciára. A * szignifikáns különbséget jelent a kontroll csoporthoz viszonyítva, a # szignifikáns eltérést jelöl a HFD kontroll csoporthoz képest.

A HEGC-re a 6 hetes kezelés végén került sor. Az éhgyomri vércukor szinteket vizsgálva (6Aábra) enyhe emelkedés látható az összes zsírdús tápon tartott csoportban a normál kontrollhoz képest, de ez még nem szignifikáns, csak egyfajta tendencia látható. A glükóz infúziós ráta (6B ábra), amely a teljes inzulinérzékenységet mutatja, viszont nem mozdult el lényegesen sem a diosgeninnel kezelt, sem pedig a görögszénás csoportokban, tehát a clamp alapján az állatok inzulinérzékenysége nem romlott lényegesen a kezelés időtartama alatt.

6. ábra. A diosgenin és görögszéna mag hatása az éhgyomri vércukorszintre és inzulinérzékenységre.

Bélmotilitás

A bélmotilitás vizsgálat során nem találtunk eltérést a domináns frekvenciák és domináns erő értékeiben az egyes csoportok között, eredményeink alapján tehát azt mondhatjuk, hogy a görögszéna mag és a diosgenin nem befolyásolja a bélperisztaltikát.

Echocardiográfiás mérések

Minden vizsgálatot 15 percen belül sikerült kivitelezni és mind a légzés, mind pedig a szívfrekvencia stabil maradt a procedúra alatt. A diosgenin és görögszénamag-kezelések nem fejtettek ki szignifikáns változást a szív szisztolés paramétereire, mind az ejekciós frakció, mind az aorta kiáramlási értékek a normál tartományban maradtak. A kezelések a szív diasztolés értékeit sem befolyásolták számottevően, nem találtunk különbséget a kontroll, illetve a kezelt csoportok állatai között.

Összefoglalás

Összességében elmondható, hogy a görögszénával történő kezelés fokozta a zsír- és cukor dús étrend testsúlynövelő hatását, ezzel egyidejűleg a test zsírtartalmát is annak ellenére, hogy kalóriafogyasztásuk nem volt több a kontroll állatokhoz képest. A glükóz tolerancia jelentősen romlott, és az éhgyomri vércukor értékek is fölfelé mozdultak a 6. hét végére. A görögszéna tehát nem tudta ellensúlyozni a civilizációs étrend negatív anyagcsere hatásait, sőt inkább felerősítette azokat.

A görögszéna mag számos hatóanyaga közül a diosgenint választottuk ki még a vizsgálatunkhoz. Ennek hatása azonban nem korrelált a görögszéna mag előbb ismertetett élettani hatásaival, sőt, dózisfüggő hatást sem láttunk. Konklúziónk, hogy a diosgenin önmagában nem okoz különösebben testsúly, illetve zsírgyarapodást, hanem valószínűleg komplex módon a görögszéna mag többi hatóanyagával együtt, szinergista módon hat.

Ugyanakkor megállapítottuk azt is, hogy a vizsgált anyagok nem befolyásolják a légzést és a szívműködést, tehát a görögszéna mag, illetve a diosgenin biztonságosan alkalmazható hatóanyagok a szív és érrendszeri mellékhatások tekintetében.

A munka az AGR_PIAC_13-1-2013-0008 projekt keretében valósult meg.

(Debreceni Egyetem - KovÁcs Diána, Hegedűs Csaba, Németh József, Kurucz Andrea, Varga Balázs, Bombicz Mariann, Priksz Dániel, Kozma Krisztina, Hortobagyi Tibor, Anton Pál, Juhász Béla, Szilvássy Zoltán, Kiss Rita)