Fluor-18 izotóppal jelzett potens melanin koncentráló hormon radioszintézise

A melanin-koncentráló hormon (MCH) egy 19 aminosavból álló ciklikus neuropeptid, melyet először a lazac hipofízisében írtak le, mint a bőr világosodását kiváltó hormont. Az MCH-t az emlősagy sejtjei is expresszálják, de a bőr pigmentációját ezekben az állatokban nem befolyásolja.

Az MCH fontos szerepet játszik a szervezet energiaháztartásának szabályozásában, leginkább a táplálék felvétel illetve az alvás ébrenlét ciklus területén. Intracerebrálisan adott MCH növeli a tápfelvételt, az éheztetés pedig aktiválja az MCH tartalmú neuronokat. Az MCH receptoroknak két altípusa közül az MCHR1 működését gátlóantagonistákra általánosan jellemző, hogy csökkentik a testsúlyt és a tápfelvételt. Emiatt és más patológiás folyamatokban játszott szerepük miatt az innovatívgyógyszer gyártók látóterébe is bekerültek. Több áttekintő cikk számos molekuláról, mint MCHR1–t célzó gyógyszerjelöltekről számol be.

A pozitron emissziós tomográfia (PET) az egyik legmodernebb funkcionális képalkotó eljárás, amellyel háromdimenziós képet nyerhetünk a test egy adott területéről. A pozitron emissziós tomográfia működése azon alapul, hogy rövid felezési idejű, pozitront sugárzó izotópokkal jelölt molekulák segítésével képes a szervezet biokémiai folyamatait ábrázolni. Így a receptorok eloszlását és aktivitását is meg lehet jeleníteni. A PET vizsgálatokhoz leggyakrabban Fluor-18 vagy szén-11 izotópokat alkalmaznak, amelyek felezési ideje 110 illetve 20 perc. Ez azt jelenti, hogy szinte minden vizsgálathoz frissen kell előállítani a jelzett anyagokat, és azokat célszerű a készítés helyszínén felhasználni.

Az MCH 1 típusú receptorát pozitron emittáló izotópokkal jelzett molekulák segítségével eddig csak a bécsi egyetem kutató csoportja próbálta vizsgálni. Philippe és munkatársai a mind C-11 és F-18 izotópokkal jelöltek molekulákat, nevezetesen a SNAP7941 fantázia nevű molekula származékait. Érdekes módon, bár a jelöletlen molekulának volt fiziológiai hatása, a C-11 jelzett molekulát- amely kémiailag semmiben nem különbözik az eredetitől- az agyban lévő PgP pumpa nem engedte át a véragy gáton[3]. A fluor 18 izotóppal jelzett, némileg módosított trészer viszont megjelent az agyban [4]. Az utóbbi molekula viszont nem volt stabil, az észterkötés menténelbomlott, radioaktív fluorobenzilalkoholmetabolitot eredményezve.

Haga és munkatársai írták le először a4-[(4-fluorobenzil)oxi]-1-[4-[2-(pirrolidin-1-il)etoxi]-fenil]piridin-2(1H)-one (FP-PEPP) molekulát, amely jó affinitással és szelektíven kötődik a MCHr1 receptorokhoz (IC50=5,6 nmol), és sikeresen áthatol a véragy gáton is.

Munkánk célja ennek a molekulának a fluor-18 izotóppal történő jelzése volt. Olyan pozícióban próbáltuk megjelölni a molekulát, hogy metabolikusan stabil legyen, ne hasadjon le radioaktív kis molekula, ami zavarhatná a képalkotást, illetve a vizsgálat kiértékelését. A molekula bizonyítottan bekellhatoljon az agyba és ott specifikusan kötődnie kell. Miután a molekula inaktív formája kereskedelmi forgalomban elérhető „TC-MCH 7c” néven, referencia anyagként ezt használhattuk. A prekurzor molekula szintézisének megvalósítása a projekt egyik sarokpontja volt. Egy olyan radio-diagnosztikum létrehozása volt a cél amelylehetőséget ad az agyi és perifériális MCH 1 típusúreceptorok illetve a rájuk ható gyógyszerektanulmányozására.

Módszerek:

A radio-szintézishez szükséges prekurzor a 4-bromo-1-[4-(2-pirrolidin-1-yl-etoxi)-fenil]-1H-pyridin-2-one (BrPEPP) előállítása egy 3 lépéses szintézissel történt az ABX cégnél. A szintézis lépéseit az 1. ábra mutatja.

1. ábra A prekurzor szintézise 4-bromo-1-[4-(2-pirrolidin-1-yl-etoxi)-fenil]-1H-pyridin-2-one (BrPEPP) szintézise (1: Reagenek és körülmények: (i): 4-(tert-Butildimetilsililoxi)-fenilbórsav, Cu(OAc)2, pyridine, CH2Cl2; (ii): 1 M Bu4NF THF-ben; (iii): DEAD, PPh3, THF, 2-Pirrolidin-1-il-etanol
1 4-Bromo-1H-piridin-2-on
2 4-(tert-Butildimetilsililoxi)fenilbórsav
3 4-Bromo-1-[4-(tert-butil-dimetil-silaniloxi)-fenil]-1H-piridin-2-on
4 4-Bromo-1-(4-hidroxi-fenil)-1H-piridin-2-on
5 2-Pirrolidin-1-il-etanol
6 4-Bromo-1-[4-(2-pirrolidin-1-il-etoxi)-fenil]-1H-piridin-2-on)

A radioaktív szintéziseket TracerlabFx FE illetve TracerlabFx FDG szintézismodulokkal végeztük. Első lépésben F-18 izotópokat állítottunk elő az 18O(p,n)18F magreakcióval. A keletkezett fluorid ionokat anioncserélő oszlopon (QMA) választottuk el, majd kálium-karbonát és kriptofix 2.2.2. elegyével eluáltuk. Az eluátumot szárazra pároltuk, majd reagáltattuk 4-formil-N,N,N-trimetilaniliniumtrifláttal (7) 80 oC-on 5 percig. A keletkezett [18F]fluoro-benzaldehidet(FBA, 8) C-18 szilárdfázisú extrakciós oszlopon választottuk el a reakcióelegyből. Az oszlopon megkötött FBA-t NaBH4 vizes oldatával 4- [18F]fluoro-benzil-alkohollá (FBOH, 9) redukáltuk, majd vízzel mostuk. Az oszlopon levő FBOH-tHe áramban szárítottuk. A szárítás végpontját hőmérséklet méréssel állapítottuk meg. A száraz FBOH NaH jelenlétében reagált a végtermék prekurzorával 100 fokon 15 percig. A keletkezett terméket

2. ábra A radioaktív szintézis reakcióegyenlete (a vegyületek neve a szövegben van feltüntetve)

félpreparatív HPLC módszerrel, 5 µm-esNucleodurPyramid 10x250mm oszlopon acetonitril és 0,1 % TFA oldat 63:35 arányú keverékét eluensként használva tisztítottuk. A terméket, amelynek retenciós ideje 15-18 percnek adódott, összegyűjtöttük, vízzel hígítottuk, majd egy C18 alapú szilárdfázisú extrakciós oszlopon megkötöttük. A [18F]FP-PEPP molekulát etanollal eluáltuk az oszlopról, és só oldattal hígítva 10 % etanol oldatban adtuk át további vizsgálatokra.

Eredmények:

A két óra hosszúságú, több lépéses szintézis bomláskorrigált hozama 20±10 % volt, amiegy-egy alkalommal 100-3000 MBq aktivitású [18F]FB-PEPP-t eredményezett. A termék radiokémiai tisztasága < 95%, moláris aktivitása a szintézis végére számolva 112± 104 GBq/μmol volt.A termék reprezentativkromatogrammját a 3. ábra mutatja.

3. ábra A [18F]FP-PEPP analitikai HPLC kromatogrammja (körülmények: NukleodurPyramide 250x4,6 mm oszlop 5 µm szemcsemérettel, 35:65 0,1 % TFA acetonitril futtató elegy 1ml/perc áramlási sebesség)

Konklúzió:

Munkánk eredményeképpen rendelkezésre áll egy hasznos PET radiodiagnosztikum amely felhasználásával állattenyésztési kutatások során haszonállatok táplálkozásának befolyásolása vizsgálható. Később ez a jelzett molekula obezitás és diabetes elleni gyógyszerek tanulmányozását segítheti.

A [18F]FB-PEPP segítségével az MHCR1 működésének módosítására szolgáló molekulák preklinikai vagy klinikai tesztjének lehetőségét teremtettük meg. A molekulát fizikai és kémiai tulajdonságai alkalmassá teszik a vér-agy gáton való áthatolásra, így az használható agyi receptorok leképezésére is.

Ez a munka az AGR_PIAC_13-1-2013-0008 pályázati támogatással készült.

(Debreceni Egyetem - Mikecz Pál, Lima Oubina Ana, Miklovicz Tünde, Fekete Anikó, Dűrgő Brigitta1, Nagy Tamás, Péliné Szabó Judit, Trencsényi György; ABX advancedbiochemicalcompoundsRadeberg, Németország - Marton János, Kerstin Wolf)