Melanin koncentráló hormon (MCH) tartalom meghatározása patkány szervekben RIA alkalmazásával

A Debreceni Egyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetében egy specifikus radioimmunoassay (RIA) módszert fejlesztettünk ki a melanin koncentráló hormon (MCH) mérésére.

Az MCH ellenes antiszérumot nyulak immunizálásával állítottuk elő. Az MCH 125I izotóppal történő jelölését jodogénes módszerrel végeztük, majd a mono-jódozott peptidet fordított fázisú HPLC-vel különítettük el. Az MCH specifikus RIA módszerünk kimutatási határ koncentrációja: 0,2 fmol/ml. Az új RIA módszer gyakorlati alkalmazásaként különböző patkány szervek MCH koncentrációját határoztuk meg. Magas MCH koncentrációkat detektáltunk a vékonybélben, a hasnyálmirigyben, a vesében, a májban és a légcsőben.

Bevezetés

Az MCH-t elsőként 1983-ban lazacok agyalapi mirigyéből izolálták és azonosították kémiai szerkezetét. Biológiai hatását tekintve fontos szerepet játszik a csontos halak bőrének pigmentációs szabályozásában. Pár évvel később patkány hypothalamusból is sikerült izolálni az MCH-t. A patkány és egyben az emlős MCH nem azonos a korábban lazacokból izolált MCH-val. Az emlős MCH 19 aminosavból áll, amelyben di-szulfid híd kapcsolja össze a 7-es és 16-os pozícióban található Cys aminosavakat. A kémiai szerkezet és biológiai hatás összefüggéseit vizsgáló kísérletek során kimutatták, hogy a hurkos szerkezet elengedhetetlen a biológiai aktivitás szempontjából, valamint hogy a gyűrűben található Arg és Tyr aminosavak fontos szerepet töltenek be az MCH biológiai hatásának kialakulásában. A peptid emlősökben játszott élettani szerepével kapcsolatban kimutatták, hogy kulcsszerepet tölt be a táplálkozási viselkedés szabályozásában. Kontroll alatt tartja az energia egyensúlyt, a táplálék felvételt, a testsúlyt, valamint az anyagcserét. MCH adásával fokozható a táplálék felvétel, ami hosszú távon súlygyarapodáshoz, majd elhízáshoz vezet. Ezeken túl bizonyítottan, vagy feltételezhetően részt vesz a cukorbetegség kialakulásában, valamint az alvás-ébrenlét ciklus szabályozásában.

Munkacsoportunk, amely a táplálkozás, az obezitás, az inzulin rezisztencia és a diabétesz témakörben végez tudományos munkát, fontosnak tartotta egy érzékeny és specifikus MCH radioimmunoassay (RIA) módszer kifejlesztését, amelyek segítségével vizsgálni tudjuk a peptid szöveti eloszlását és plazma szintjét.

MCH RIA kifejlesztése

Az MCH RIA kifejlesztéséhez szükséges peptid szilárd fázisú szintézise a Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Vegytani Intézetében történt, prof. Dr. Tóth Gábor vezetése mellett. Az MCH ellenes antiszérumot nyulak immunizálásával állítottuk elő MCH-BSA immunogént használva oltóanyagként. RIA kifejlesztésére az „MCH1/5” jelzésű antiszérum bizonyult a legalkalmasabbnak az 1:35000 hígításban. Az MCH 125I izotóppal történő jelölése jodogénes módszerrel történt, majd a RIA tracert fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. RIA standardként a patkány MCH peptidet használtuk a 0-200 fmol/ml koncentráció tartományban. RIA pufferként a 0,05 mol/l koncentrációjú, pH=7,4 foszfát puffert alkalmaztuk, amely 0.1 mol/l NaCl-t, 0,25% BSA-t és 0,05% NaN3-t tartalmazott. Az MCH RIA optimális működési körülményei: a polipropilén assay csövekbe az assay pufferen kívül bemértünk 100 µl antiszérumot (munkahígítás 1:3500), 100 µl RIA tracert (3000 cpm/cső) és 100 µl megfelelő koncentrációjú standardot, valamint az ismeretlen antigén tartalmú mintákat. A végtérfogat mindegyik csőben 1 ml volt. A 48 órás, 4 °C-on történő inkubációt követően az antitestekhez hozzákötődött és szabadon maradó peptid frakciókat dextránnal bevont csontszenes módszerrel különítettük el egymástól. Centrifugálást követően (4000 rpm, 4 °C, 10 min) a felülúszókat leöntöttük, majd gammasugárzás mérővel meghatároztuk az üledékek radioaktivitását. Az ismeretlen minták MCH koncentrációját kalibrációs görbéről olvastuk le.

MCH RIA gyakorlati alkalmazása

Új MCH RIA módszerünk gyakorlati alkalmazásaként patkány gyomor-bél traktus, valamint perifériás szervek MCH tartalmának eloszlását vizsgáltuk A szövetminták feltárása neutrális extrakcióval történt. A minták súlyát megmérve, desztillált víz hozzáadásával 10%-os homogenizátumokat készítettünk. A homogenizátumok centrifugálását követően az MCH tartalom meghatározása a felülúszókból történt, majd a peptid tartalmat nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fmol/mg egységben fejeztük ki.

Patkány szövetminták MCH tartalma

A vizsgált patkány szervek MCH tartalmára vonatkozó mérési eredményeinket az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat: MCH tartalom megoszlása patkány szervekben
A táblázatban 8 mérés átlagát és annak közepes hibáját (SEM) tüntettük fel. A mérési eredményeket fmol/mg egységben fejeztük ki.

Nagyon magas MCH koncentrációt mértünk a vékonybélben, elsősorban a patkóbélben, majd ezt követte az éhbél és a csípőbél. Szintén magas MCH koncentrációkat találtunk a hasnyálmirigyben és a vesében. Alacsonyabb MCH tartalom volt kimutatható a légcsőben és a májban.

Megbeszélés

A gyomor-bél traktus, valamint a perifériás szervek MCH tartalmának eloszlására vonatkozó eredményeink teljesen új irodalmi adatokat szolgáltattak. A bemutatott kísérleti eredményeink és tudományos ismereteink alapján feltételezzük, hogy az MCH, más biológiailag aktív peptidhez (szomatosztatin: hasonlóan a szervezetben kettős szereppel rendelkezik. Egyrészt idegi mediátor (neuro-transzmitter) a központi idegrendszerben, másrészt étkezés hatására felszabaduló gasztrointesztinális keringő hormon is, amely fontos szerepet játszhat nemcsak a táplálékfelvétel szabályozásában, hanem az emésztés folyamatában is. Feltételezhetően hatással van olyan betegségek kialakulására, mint a kóros elhízás, vagy éppen a kóros soványság. Nagy érzékenységű és specifikus MCH RIA módszerünk klinikai alkalmazása (plazma MCH koncentráció meghatározás) új eredményekkel szolgálhat az elhízás folyamatának tanulmányozása során, és távlatokat nyithat akár még eddig ismeretlen kórképek (pl. MCH termelő adenoma) megismerésében is.

Támogatás

A tudományos kutatás a Magyar Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal AGR-PIAC-13-1-2013-0008 számú projektjének támogatásával készült.

(Debreceni Egyetem - Lelesz Beáta, Juhász Béla, Kiss Rita, Szilvássy Zoltán, Felszeghy Enikő, Németh József)